Biokatalytische cascades maken de productie van het macrocyclische peptide Enlicitide mogelijk

De orale PCSK9-remmer van MSD, enlicitide decanoaat (MK-0616), is de eerste orale macrocyclische peptide PCSK9-remmer die een substantiële LDL-C-verlaging bij mensen aantoont. Enlicitide werd ontwikkeld op basis van een mRNA-weergavescherm van monocyclische peptiden en vervolgens gestabiliseerd door middel van niet-peptidische verknopingen om een ​​structuur te genereren die drie gefuseerde macrocycli omvat. Dit complexe octapeptide bevat zes onnatuurlijke en twee proteïnogene aminozuren verbonden door twaalf amidebindingen en een centrale ketenlinker met zes koolstofatomen. Traditionele chemische synthese vereist 43 stappen, manipulaties van beschermende groepen (bijna de helft van de synthetische stappen), chromatografische zuiveringen en een sterk verdunde, door ruthenium gekatalyseerde ringsluitingsmetathesestap, waardoor de schaalbaarheid en duurzaamheid worden beperkt.

Ontwikkeling van chemo-enzymatische productie

De MSD-wetenschappers ontwikkelden een beknopt en convergent chemo-enzymatisch proces om enlicitide-decanoaat (1) te produceren, mogelijk gemaakt door de directe koppeling van monomeren door aminozuurligasen, gecombineerd met biokatalytische ligatie van peptidefragmenten en macrocyclisaties met behulp van esterasen en imine-reductasen.

Belangrijkste prestaties

Cascadeassemblage met drie enzymen met behulp van ATP-grijpligasen

- Cascade met drie enzymen (twee speciaal ontworpen ATP-grijpligasen + ATP-recycling) assembleert een tetrapeptide uit onbeschermde aminozuren. ATP-grijpligasen (specifiek ATP-afhankelijke aminozuurligasen, AAL's) zijn enzymen die de vorming van amidebindingen tussen onbeschermde aminozuren of peptiden katalyseren met behulp van ATP als energiebron. Hun mechanisme verloopt via een gemengd anhydride-tussenproduct, dat directe koppeling mogelijk maakt zonder dat er beschermende groepen op het nucleofiele amine of geactiveerde acyldonoren nodig zijn. In deze studie gebruikten de onderzoekers een ATP-grijpligase van Bifidobacterium adolescentis (BaAAL) en gemanipuleerde varianten (Trp-BaAALEng en Phe-BaAALEng) om selectief een dipeptide uit te breiden met twee niet-natuurlijke aminozuren (tryptofaan en fenylalanine-analogen) in een cascade van één pot. Deze ligasen hebben een smalle, begraven elektrofiele pocket die afzonderlijke aminozuren accepteert als elektrofielen (C-terminale substraten), maar langere peptiden kan huisvesten als N-nucleofielen. Deze selectiviteit maakt ze ideaal voor opeenvolgende, beschermende groepvrije peptideassemblage van het C-uiteinde naar het N-uiteinde. Het verbruikte ATP wordt gerecycled met behulp van een polyfosfaatkinase (FbPPKWT) met goedkoop hexametafosfaat als fosfaatdonor.

Engineered esterase (RsEstEng) regioselectieve macrolactamisatie

- Engineered esterase (RsEstEng) katalyseert regioselectieve macrolactamisatie om het Northern-fragment te vormen (73% opbrengst, schaal van 52 kg). RsEstEng is afgeleid van een wildtype carboxylesterase (RsEst) geïdentificeerd uit Roseibacillus sp. De oorspronkelijke functie ervan is hydrolyse van esterbindingen. Door middel van gerichte evolutie hebben de onderzoekers het omgezet in een katalysator voor regioselectieve macrolactamisatie – de vorming van een macrocyclische amidebinding – bij de synthese van het noordelijke fragment (4) van enlicitide. Het accepteert de stabiele, omvangrijke tert-butylester van het lineaire tetrapeptide (9) als de acyldonor om het macrocyclische peptide (4) te produceren om een ​​intramoleculaire amidebinding te vormen. Het bereikte selectieve cyclisatie zonder detecteerbare oligomeren en slechts 0,8% esterhydrolyse-bijproduct, zelfs onder de omstandigheden met hoge ionsterkte van de eerdere enzymatische cascade.

Engineered thioesterase (BlTEEng) intermoleculaire ligatie

- Engineered thioesterase (BlTEEng) voert intermoleculaire ligatie uit van noordelijke (4) en oostelijke fragmenten (3) zonder epimerisatie. BlTEEng is een gemodificeerde versie van een thioesterase (TE) domein dat oorspronkelijk uit het niet-ribosomale peptidesynthetase (NRPS) van Brevibacillus laterosporus (BlTE) is gesneden. Wildtype thioesterasen in NRPS-systemen katalyseren doorgaans macrocyclisatie of afgifte van lineaire peptiden uit een dragereiwit via een thioesterbinding. De gemanipuleerde varianten van BlTE vertoonden enige activiteit, maar gaven de voorkeur aan dimere bijproducten. Enzymmanipulatie heeft het enzym verplaatst om intermoleculaire ligatie te katalyseren met behulp van stabielere isopropyl-oxo-esters in plaats van de natuurlijke, hydrolytisch labiele thio-esters.

Vier-enzym cascade-reductieve aminering macrocyclisatie

- Cascade met vier enzymen (PsIREDEng, KsKREDENg en cofactor-recycling-enzymen StLDHWT, TvADHWT) bereikt reductieve amineringsmacrocyclisatie om een ​​bicyclisch diamine te vormen (opbrengst 69%, schaal van 46 kg). KsKREDeng is een technisch ketoreductase van Kyrpidia sp. Het katalyseert de oxidatie van een benzylalcoholverbinding (10) tot een tijdelijk aldehyde (11) dat afhankelijk is van NAD+. PsIRED is een iminereductase van Pseudogymnoascus sp. Het is NADPH-afhankelijk. PsIREDEng katalyseert de reductieve aminering van het aldehyde (11) en het bestaande amine om het cyclische imine (12) te vormen, gevolgd door reductie tot de secundaire aminemacrocyclus (13). StLDHWT regenereert NAD+ voor de oxidatieve stap door pyruvaat te reduceren tot lactaat, terwijl TvADHWT NADPH regenereert voor de reductieve stap door isopropanol te oxideren tot aceton.

Laatste macrocyclisatie via gemanipuleerde PBP-thioesterase

- Chemische koppeling met het Western-fragment (2), gevolgd door technisch penicilline-bindend eiwitthioesterase (SsPBP-TEEng), sluit de laatste macrocyclus bij hoge concentratie (70 g/l) – waardoor de typische verdunningsbeperking (5 g/l bij traditionele synthese) wordt overwonnen. Het totale proces omvat drie cascadestappen, 7 technische + 3 hulpenzymen, een totale opbrengst van 39%, demonstratie op multikilogramschaal, >99% zuiverheid, geen chromatografie en geen beschermende groepen. Dit werk biedt een duurzame, schaalbare blauwdruk voor de productie van complexe macrocyclische peptiden, waardoor het aantal stappen en de verspilling dramatisch worden verminderd en tegelijkertijd de efficiëntie en de toegang voor patiënten worden verbeterd.